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Laboratory diagnosis of spinal tuberculosis: past and present
S.A. Patwardhan*, S. Joshi Deenanath Mangeshkar Hospital and Research Centre, Erandawane, Pune - 411004, India *

ARTICULO DE REVISIÓN

Laboratory diagnosis of spinal tuberculosis: past and present
S.A. Patwardhan*, S. Joshi Deenanath Mangeshkar Hospital and Research Centre, Erandawane, Pune - 411004, India *

Resumen: La tuberculosis espinal suele tener un curso indolente y puede ser un reto diagnóstico. El oportuno diagnóstico de laboratorio ayuda a iniciar el tratamiento temprano y previene la aparición de complicaciones graves. Técnicas como la tinción de Ziehl-Neelsen, la histopatología y la cultura en medios sólidos se han utilizado convencionalmente para el diagnóstico de laboratorio de la tuberculosis. La disponibilidad de cultivo de líquido TB y pruebas de diagnóstico molecular ha ayudado a aumentar la sensibilidad del diagnóstico y dar resultados rápidos. Sin embargo, estas ayudas de diagnóstico demandan la maestría técnica y control de calidad riguroso. El alto costo también limita el uso de estas nuevas técnicas en países pobres que representan el mayor reservorio de tuberculosis.
Palabras clave: tuberculosis, columna vertebral, cultivo AFB, histopatología, pruebas genotípicas

La tuberculosis (TB) ha afectado a la raza humana desde tiempos inmemoriales y ha sido la enfermedad asociada con la pobreza y el hacinamiento. A pesar de que la quimioterapia eficaz ha estado disponible para el tratamiento de la tuberculosis durante más de 50 años, sigue siendo un desafío para los programas de prevención y control a nivel mundial. La OMS ha declarado la tuberculosis una emergencia mundial en 1993. La carga mundial de la enfermedad en 2009 fue de 9,4 millones de casos de incidentes, 14 millones de casos prevalentes y alrededor de 1,7 millones de muertes [1]. La OMS estima que un tercio de la población mundial está infectada con Mycobacterium tuberculosis formando un enorme depósito de futuros pacientes. Con la pandemia del VIH, la tuberculosis, incluyendo la resistencia a múltiples fármacos (MDR) y extensamente resistente a los fármacos (XDR), ya no está restringida a las regiones en desarrollo y pobres del mundo. El diagnóstico oportuno y preciso de la TB tiene un papel muy importante en el tratamiento y control de la enfermedad. Es de vital importancia que los laboratorios de microbiología tanto públicos como privados mantengan la capacidad de detectar M. tuberculosis a partir de especímenes de pacientes y determinar correctamente la presencia de resistencia a fármacos. La disponibilidad de mejores métodos de cultivo de TB y técnicas de amplificación de ácido nucleico en los últimos años parecen haber superado las limitaciones de baja sensibilidad y retraso en el diagnóstico asociado con las pruebas convencionales. [2] Con la pandemia del SIDA, la incidencia de TB diseminada y extrapulmonar está aumentando. La tuberculosis ósea y articular puede representar hasta el 35% de los casos de tuberculosis pulmonar extra [3] y la tuberculosis espinal representa aproximadamente el 50% de los casos de tuberculosis pulmonar extra.
Casos de tuberculosis esquelética [4]. La tuberculosis espinal a menudo tiene un curso clínico indolente y un alto índice de sospecha clínica es necesaria para el diagnóstico. Si no se diagnostica oportunamente, puede conducir a complicaciones graves como abscesos paravertebrales y secuelas neurológicas.

I - MICROSCOPIO Tinción  de Ziehl-Neelsen La demostración de bacilos ácido-rápidos (AFB) usando la tinción de Ziehl-Neelsen (Z-N) es un método simple, rápido y convencional para detectar bacilos de TB. Sin embargo, su sensibilidad se ve afectada por la habilidad y la experiencia del microscopista. Para detectar 1-2 organismos en 300 campos de inmersión en aceite, la concentración de las bacterias en la muestra debe ser 5000-10000 por ml [5]. M. tuberculosis en la tincion  ZN aparece como delgado, curvado, beaded ácido-rápido bacilos. Debido a su baja sensibilidad, la probabilidad de encontrar AFB en muestras extrapulmonares paucibacilares es mucho menor. En nuestra experiencia, la realización de tinción de ZN después de la descontaminación y la concentración de los especímenes por el método NaOH-NALC aumenta la positividad de la BFA en un 10%. ? Tinción  de fluorocromo Métodos de tinción con fluorocromo tales como auramina y rodamina se unen a la pared celular de ácido micólico de micobacterias, que aparecen como amarillo brillante o naranja contra un fondo verde en microscopía de fluorescencia. Fluorochrome procedimiento de tinción es fácil de realizar. Las diapositivas se observan con un aumento menor y, por lo tanto, áreas más amplias del frotis pueden ser rastreadas rápidamente conduciendo a un aumento de la sensibilidad de detección. La tinción de Fluorochrome  tiene aproximadamente un 10% mayor sensibilidad que  la de ZN  [6]. Una desventaja potencial de la microscopía de fluorescencia es la posibilidad de resultados positivos falsos debido a la muestra de fondo que incorpora el colorante flurocromo. Por lo tanto, la especificidad se ve comprometida en el caso de un microscopista no entrenado. Se recomienda que los frotis de fluoruro que sean positivos para la BFA se vuelvan a teñir con un método de tinción con carbolfucsina para confirmar los resultados y aumentar la especificidad. El alto costo de los microscopios fluorescentes es una limitación en los entornos de bajos recursos. Recientemente, la disponibilidad de diodos emisores de luz ultravioleta de bajo costo (LEDs) ha ofrecido una alternativa fácil al microscopio de fluorescencia [7]. Estos LEDs se pueden montar en un microscopio de luz, son portátiles y tienen una vida de hasta 50.000 horas.

II - HISTOPATOLOGÍA La reacción tisular típica en la inflamación tuberculosa es la formación de un tubérculo. Es una reacción a los bacilos infecciosos tuberculosos y comienza como la infiltración gradual por los linfocitos y los monocitos junto con un grupo histiocytes especializado de las células llamadas "macrófagos epitelióides". A medida que los monocitos y las células epitelióides aumentan en número, tienden a formar una masa o tubérculo aproximadamente de forma esférica. A medida que el tubérculo aumenta de tamaño su porción central sufre caseación. Esta es una forma de cambio degenerativo en el que las células mueren, perdiendo sus características de tinción y desintegrándose sin licuefacción para formar un residuo finamente granular. En este área central caseosa puede haber un número variable de gotitas de grasa y fragmentos de células en diversas etapas de degeneración. Su zona periférica está compuesta por células epitelióides muertas o moribundas. Además de las células epitelióides, el tubérculo generalmente contiene una o más células gigantes del tipo epitelioide o Langhans. Éstas tienden a ser más pequeñas que las células gigantes del cuerpo extraño; Se caracterizan por un área central finamente granular de protoplasma y presentan una tendencia a que los núcleos se dispongan alrededor de la periferia de la célula. La célula gigante epitelióide puede alcanzar un tamaño considerable y contener veinte o más núcleos, pero por regla general es relativamente pequeña y contiene sólo seis u ocho núcleos. Las células gigantes del cuerpo extraño que aparecen más adelante en la enfermedad pueden ser mucho más grandes y pueden contener 200 o más núcleos, que se dispersan irregularmente a través de la célula. Si el tubérculo se secciona y se tiñe para los organismos ácido-rápidos, algunos bacilos del tubérculo pueden ser encontrados en las secciones. Estos pueden estar en el material caseoso o extracelular en la masa de células epitelióides, pero normalmente están en estas células o en las células gigantes. En nuestra experiencia, sin embargo, es difícil encontrar los organismos en secciones de infecciones de hueso tuberculoso. La necrosis de la porción central del tubérculo parece ser debido a una falta de suministro de sangre en lugar de a cualquier efecto tóxico del bacilo de la tuberculosis en las células epitelióides o células gigantes. Alrededor de la periferia de la masa de células epitelióides se encuentra una zona de pequeñas células redondas o células linfoides, y fuera de ésta se desarrolla una zona de inflamación no tuberculosa en la que los vasos sanguíneos más pequeños se incrementan en tamaño y número y en los que hay una Proliferación leve de células fijas de tejido conectivo, pequeñas células redondas y macrófagos. Este tejido es edematoso y posee un delicado tejido conectivo. En los casos en que la resistencia del individuo es suficiente para hacer frente a la infección, los fibroblastos en esta zona proliferan y forman una cápsula de tejido fibroso rico en colágeno, que rodea al tubérculo minuto. En el individuo en el que se desarrolla el absceso de Pott, no se forma una cápsula adecuada y las células epitelióides, las células inflamatorias y los bacilos tuberculosos invaden los tejidos óseos, cartilaginosos y fibrosos de la región como en un proceso neoplásico. Su periferia es altamente vascular, pero su porción central está tan llena de células que los vasos sanguíneos se obliteran y, en consecuencia, esta área degenera y se forma un absceso tuberculoso. Este tejido de granulación puede contener un número variable de bacilos tuberculosos. La cavidad del absceso contiene restos celulares y material caseoso, pero su contenido es más líquido.
Durante la fase activa de la enfermedad, la pared del absceso tuberculoso se compone de tejido de granulación tuberculoso respaldado por tejido conectivo fibroso, secreciones y suele ser rico en bacilos tuberculosos. Los granulomas bien formados carecen en esta etapa y el diagnóstico depende en gran medida de encontrar colecciones de histiocitos epitelióides, material caseoso y demostración de bacilos tubercu- lares por tinción de ZN

III - PRUEBAS DE CULTIVO Y SUSCEPTIBILIDAD-DROGA (DST) La cultura de M. tuberculosis es el patrón oro para el diagnóstico de TB. Es mucho más sensible que la microscopía de frotis y puede detectar entre 10 y 100 micobacterias viables por ml de muestra. ? Métodos de cultivo convencionales Convencionalmente se utilizan medios sólidos basados ​​en huevo / agar, tales como medio Löwenstein-Jensen (LJ), Middlebrook 7 H10 o 7H11 para cultivar M. tuberculosis. Debido al lento tiempo de duplicación de M. tuberculosis, se tarda alrededor de 3 a 4 semanas de cultivo en estos medios para que el organismo crezca. La prueba de susceptibilidad a fármacos (DST) en medios sólidos es pesada de llevar a cabo, toma aproximadamente 1 a 2 meses y produce resultados variables. ? Técnicas rápidas de cultivo líquido automatizado El cultivo de medios líquidos aumenta el rendimiento en un 10% en comparación con los medios sólidos y también reduce el retraso en los resultados (datos no publicados del autor). La OMS recomienda la adopción de sistemas de cultivo líquido para fortalecer la capacidad de los laboratorios de TB [8]. Los sistemas líquidos son, sin embargo, más propensos a la contaminación y requieren la manipulación de grandes volúmenes de material infeccioso. Medidas de bioseguridad adecuadas y procedimientos de descontaminación específicos para evitar la contaminación cruzada son obligatorios para obtener resultados confiables. [9] /// Tubo indicador de crecimiento micobacteriano (MGIT) MGIT es la tecnología de vanguardia para el aislamiento rápido de micobacterias. El sistema viene como una capacidad de tubo 960 o 320 con la incubación a bordo y proporciona la supervisión continua del crecimiento. Utiliza medio 7H9 Middlebrook caldo modificado para el crecimiento de micobacterias. El tubo contiene un fluorocromo enfriado con oxígeno incrustado en silicio en la parte inferior. El oxígeno es necesario para el crecimiento bacteriano, el fluorocromo ya no se inhibe y la fluorescencia resultante se detecta. La identificación como M. tuberculosis se obtiene sobre la base de la susceptibilidad al ácido p-nitrobenzoico (PNBA). El DST a los fármacos antituberculosos de primera y segunda línea se realiza usando el método de proporción modificada. En nuestro centro hemos encontrado que MGIT puede detectar el crecimiento micobacteriano tan pronto como 7 a 10 días y los resultados de DST están disponibles en aproximadamente 4 semanas en promedio. /// BacT / ALERT® El sistema utiliza la detección colorimétrica del CO2 producido en el cultivo debido al crecimiento de micobacterias. Un fotodetector detecta el aumento de la luz reflejada del LED del sistema. BacT / ALERT 3D® es un instrumento versátil que permite el uso de una sola plataforma para la recuperación óptima de una amplia gama de organismos, incluyendo bacterias, levaduras y micobacterias utilizando botellas de cultivo especialmente diseñadas. La cultura es una investigación de base muy importante en tuberculosis clínicamente sospechada. Debe hacerse antes de comenzar Tratamiento antitubercular. Se utiliza un cultivo de referencia para determinar el perfil de susceptibilidad a fármacos del organismo aislado y ayuda a detectar y guiar el tratamiento de MDR y XDR-TB. Puesto que la tuberculosis espinal es una enfermedad paucibacilar y hay dificultad en la obtención de muestras de tejido repetidas por razones de diagnóstico, el valor de un cultivo de pretratamiento basal es indudable. Antes de que se demuestre resistencia en el cultivo y DST, los pacientes con falta de mejoría clínica o radiológica o aquellos con persistencia o aumento de la destrucción ósea después del inicio de la quimioterapia deberían ser etiquetados como "casos terapéuticamente refractarios" . La cirugía temprana está indicada para obtener el espécimen para el cultivo, DST y otras pruebas diagnósticas como el examen histopatológico. La intervención quirúrgica también ayuda a reducir la carga bacteriana en el sitio infectado. La eliminación del pus y del tejido necrótico facilita la penetración del fármaco. Los fármacos para tratar MDR y XDR-TB son costosos, tóxicos y necesitan ser administrados por un período de tiempo más largo; No deben utilizarse a menos que la resistencia a los medicamentos se documente en la cultura y el DST.

IV. PRUEBAS SEROLÓGICAS* A pesar de la disponibilidad de diferentes kits de detección de anticuerpos basados ​​en inmuno- cromatografía o ensayos inmunoenzimáticos (ELISA), ninguna de las pruebas serológicas es sensible y específica para diagnosticar la tuberculosis activa. Varios antígenos que se utilizan en estos kits son 38 kDa, antígeno 60, antígeno 32 kDa, etc. Las limitaciones de estas pruebas son [5]: i) Sensibilidad extremadamente baja en enfermedad paucibacilar y enfermedad extra pulmonar. Ii) Muchos ensayos usan antígeno único, p. 38 kDa que puede no ser reconocida por la respuesta inmune del huésped en todas las etapas. Iii) anticuerpos reactivos cruzados con micobacterias ambientales que conducen a resultados positivos falsos. Iv) El límite de la enfermedad activa frente a la infección es difícil de definir para países endémicos como la India. Teniendo en cuenta las evidencias convincentes de los diferentes estudios que demuestran un desempeño deficiente de las pruebas serológicas comerciales, el Grupo Asesor Estratégico y Técnico para la TB (STAG-TB) (OMS) adoptó una política recomendando que las pruebas de serodiagnóstico comerciales actuales de la TB no deberían usarse en individuos Con sospecha de tuberculosis pulmonar o pulmonar extra pulmonar independientemente de su estado serológico [11]. Se están desarrollando inmunoensayos para detectar el antígeno de M. tuberculosis. El protocolo de ELISA de captura para detectar lipoarbinomannan (LAM) en la muestra de orina o la detección semi- cuantitativa de LAM por el método de la tira reactiva parece ser prometedor.

V - MÉTODOS MOLECULARES Las pruebas de diagnóstico molecular basadas en la amplificación de ácidos nucleicos representan un avance importante en el diagnóstico de TB. Estas pruebas ofrecen una mayor sensibilidad y mayor velocidad que la serologica . Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) La PCR es una prueba en la que el ADN micobacteriano en la muestra clínica se extrae y se amplifica exponencialmente. El amplicón se detecta posteriormente usando electroforesis de gel de agarosa de rutina
O sondas oligonucleotídicas complementarias específicas. Por lo menos 10 bacilos pueden ser detectados. Se han utilizado diversos dianas de ADN micobacteriano tales como IS 6110, 16 RNA Sr, 65 kDa proteína, MPB 64. IS 6110 ha demostrado ser un buen objetivo debido a múltiples copias de esta secuencia de inserción están presentes en la mayoría de las cepas de M. tuberculosis complejo [12]. PCR es una prueba altamente sensible y específica. Una técnica de PCR anidada mejora aún más la sensibilidad. En el laboratorio, PCR anidada requiere una gran experiencia técnica y control de calidad. Incluso cantidades minuciosas de contaminación de ADN por acumulación de amplicones previos pueden resultar en falsa positividad. Dado que el ADN de los bacilos no viables también puede ser amplificado, un resultado positivo de la PCR no indica necesariamente que la enfermedad clínica activa y debe ser interpretado con cuidado, especialmente en los pacientes en tratamiento [5]. ? Amplificación Mediada por Transcripción (TMA) La TMA se dirige al ARN 16 Sr, el cual está presente en un alto número de copias en todas las células micobacterianas. Este ARNr está dirigido por la enzima transcriptasa inversa seguida de ARN polimerasa en amplificación isotérmica. La ventaja de esta técnica frente a la PCR de ADN es que, puesto que las micobacterias no viables no sufren transcripción, sólo las células viables son amplificadas y detectadas. ? Sondas de ácido nucleico Éstas son secuencias de ADN o ARN de cadena sencilla (ss) que pueden emparejarse o hibridarse con secuencias de ADN o ARN complementarias. Las sondas de ácido nucleico se usan para detectar ADN amplificado o ARN resultante de PCR o TMA. Éstos también se pueden usar para identificar un aislamiento de cultivo como el complejo M. tuberculosis o como especies micobacterianas no tuberculosas en menos de dos a cuatro horas. Se pueden usar sondas de ADN o ARN radiomarcadas o fluorescentes para localizar secuencias de ADN o ARN específicas en tejidos usando hibridación in situ. ? Ensayos de resistencia a fármacos genotípicos La cultura convencional y la DST dan resultados lentos. Durante este tiempo, los pacientes pueden ser tratados inadecuadamente y las cepas resistentes a los fármacos pueden continuar propagándose. Recientemente han aparecido nuevas tecnologías para detectar rápidamente la resistencia a los medicamentos antituberculosos. Estas pruebas se basan en el uso de ensayos de amplificación génica y detección de diferencias genéticas entre bacilos resistentes y susceptibles. Mutaciones que ocurren en diferentes genes micobacterianos. (Por ejemplo, rpoB, KatG, inhA) responsables de la resistencia a los fármacos se detectan mediante estos ensayos. I) Xpert MTB / RIF (cefeido): se trata de una prueba molecular totalmente automatizada para la detección de Mycobacterium tuberculosis (MTB) y resistencia a la rifampicina (RIF). Utiliza un ensayo de PCR en tiempo real hemi-anidado para amplificar una secuencia específica de MTB del gen rpoB, que se sonda con balizas moleculares para mutaciones dentro de la región determinante de resistencia a rifampicina. La prueba proporciona resultados en 2 horas. Esta tecnología ha sido aprobada por la OMS en diciembre de 2010 esencialmente en alta MDR y alta prevalencia del VIH configuración [13]. Ii) Ensayos de sonda de línea, p. Genotype® MTBDRsl (Hain Lifescience): la tecnología de ensayo de sonda lineal implica la extracción de ADN de M. tuberculosis a partir de muestras clínicas o aislamiento de cultivo, amplificación por PCR de la región determinante de resistencia del gen usando cebadores biotinilados. Después de la amplificación, los productos de PCR marcados  Se hibridan con sondas oligonucleátidas específicas inmovilizadas sobre una tira. Los híbridos marcados capturados son detectados por el desarrollo colorimétrico de bandas en la tira. Las mutaciones determinantes de la resistencia se detectan por falta de unión a las sondas de tipo salvaje, así como la unión a sondas específicas para las mutaciones más comunes. El Grupo Asesor Estratégico y Técnico para la Tuberculosis (STAG-TB) (OMS) declara que los ensayos de sonda de línea han sido validados adecuadamente para la prueba directa de muestras de esputo con baciloscopia positiva y de aislados de cultivo de M. tuberculosis, Muestras  negativas. No se recomienda el uso directo de estos ensayos en muestras clínicas con frotis negativos [14]. Como los ensayos de sonda de línea actuales sólo detectan resistencia a rifampicina e isoniazida, la adopción del ensayo de sonda lineal no elimina la necesidad de cultivo y DST.

VI - PRUEBAS DIAGNÓSTICAS BASADAS EN LA INMUNOLOGÍA Los métodos inmunológicos detectan una respuesta inmune a los antígenos tuberculosos y, en consecuencia, no proporcionan una medida directa de la infección activa o persistente. ? Prueba cutánea de tuberculina (TST) (prueba de Mantoux) La TST ha sido el método tradicional para la detección de la infección con bacilos tuberculosos. La infección con M. tuberculosis produce una reacción de hipersensibilidad retardada a ciertos componentes antigénicos del organismo. Se observa reactividad cutánea a la inyección intradérmica de derivado proteico purificado (PPD). La dosis estándar de prueba cutánea para PPD RT 23 (WHO-Statens Serum Institute) es de 2 TU y esta ha sido igualada para bioequivalencia a 5 TU de PPD-S (EE.UU.). TST muestra varias limitaciones cuando se utiliza como una ayuda de diagnóstico. I) Falso negativo: alrededor del 20% de los pacientes con TB activa puede tener una prueba negativa. Los falsos negativos también son altos en pacientes con SIDA avanzado. Ii) Falsos positivos: puede resultar de la exposición a micobacterias no tuberculosas o de la vacunación con BCG. Iii) Dado que una prueba positiva es una indicación de hipersensibilidad de tipo retardado, en países como la India donde la incidencia de la tuberculosis es alta, una prueba positiva puede indicar la presencia de infección pero no la enfermedad activa. La prueba es útil para detectar la tuberculosis en países donde la incidencia es baja. ? Ensayo de interferón gamma Los ensayos de liberación de gamma de interferón (IGRA) se introdujeron en 2001 para el diagnóstico de la infección por TB latente. Los IGRA son pruebas basadas en sangre que miden esencialmente la presencia de células T reactivas específicas de M. tuberculosis sensibilizadas por una infección previa con M. tuberculosis. Dos IGRA comerciales están actualmente disponibles: - CuantiFERON-TB Gold In-Tube ensayo (QTL-GIT) (Cellestis Ltd, Australia) - T-SPOT .TB (Oxford Immunotec, Reino Unido) IGRA son ensayos in vitro para demostrar la respuesta inmune celular Hacia antígenos específicos de M. tuberculosis. Estos incluyen el objetivo antigénico de la secreción temprana-6 (ESAT-6), la proteína del filtrado del cultivo 10 (CFP-10) y los antígenos TB7.7. Una ventaja de los IGRAs sobre TST es que los resultados no se confunden con la vacunación previa con BCG y es menos probable que estén influenciados por la exposición previa a la mayoría de las micobacterias no tuberculosas. IGRAs no pueden distinguir entre la tuberculosis activa y la tuberculosis latente, especialmente en los países con alta M.
Endemicidad de la tuberculosis. La sensibilidad al IGRA varía entre las poblaciones y tiende a ser menor en los países de alta endemia y en las personas infectadas por el VIH. Las recomendaciones actuales indican que las IGRAs no deben reemplazar las pruebas de diagnóstico estándar para diagnosticar TB activa ni ofrecen un valor añadido cuando se combinan con métodos estándar para diagnosticar la TB activa. Un IGRA negativo no descarta la TB activa. [15] A pesar de la disponibilidad de un número de pruebas convencionales y nuevas tecnologías para el diagnóstico de laboratorio de la tuberculosis, existen numerosos retos para el uso efectivo de estas pruebas. Las pruebas convencionales carecen de sensibilidad, consumen mucho tiempo y por lo tanto son de uso limitado para ayudar a la interrupción oportuna de la transmisión de la enfermedad, especialmente la tuberculosis MDR. Las nuevas tecnologías como los sistemas de cultivo líquido automatizado, los métodos moleculares y la determinación genotípica de la resistencia a los medicamentos necesitan experiencia, infraestructura y son caras. Los países en desarrollo que cargan la carga global máxima de la tuberculosis carecen de los recursos y por lo tanto las nuevas tecnologías no pueden llegar aquí en beneficio de las masas. El objetivo de la OMS de reducir a la mitad la prevalencia de la tuberculosis y las muertes resultantes para 2015 y eliminar la tuberculosis como un problema de salud pública antes de 2050 es menos probable si no se superan estas brechas clave. [16]

 

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